Mio pmn Bedienungsanleitung Seite 1

EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN ZUM EINFLUSS VONEICOSAPENTAENSÄURE VERSUS ARACHIDONSÄURE AUF DIEIMMUNANTWORT POLYMORPHKERNIGER NEUTROPHILERGRANULOZYTEN

10triene. Lipidmediatoren werden aus Arachidonsäure, einer mehrfach ungesättigten Fettsäure,synthetisiert.1.4. Metabolismus und physiologische Bedeutu

11Zellmembranen durch Phospholipasen beitragen (7), 15-HETE hemmt die 5-Lipoxygenase inGranulozyten (8).Alternativ kann aus 5-HPETE LTA4 synthetisier

12Abbildung 1: Metabolismus der Arachidonsäure durch 5-Lipoxygenase. Dargestelltsind die Entstehung des zentralen Produktes LTA4 sowie dessen enzymati

13 erhöhtes Angebot an Substrat (freie Fettsäure) um ein Vielfaches gesteigert werden (13).Eine Übersicht des Arachidonsäuremetabolismus zeigt Abbildu

14Abbildung 2: Das Konzept der kooperativen Eicosanoidsynthese. AusArachidonsäure (AA), das aus den Phospholipidpools der Endothelzelle (EC)freigesetz

15 durch gegenseitige Bereitstellung der notwendigen Substrate und durch ihre komplementäreEnzymausstattung, ein Mechanismus, der vermutlich der Feina

16Abbildung 3: Metabolismus der Eicosapentaensäure durch 5-Lipoxygenase. In Analogie zum Metabolismus der Arachidonsäureentsteht zunächst LTA5, welche

17 Fettsäure in Transportvesikel umgehen, so daß wesentlich höhere Konzentrationen an freierFettsäure für die Synthese aktiver Metabolite zur Verfügun

18Verwendung von ω-3-Lipidemulsionen stellt daher eine potente Quelle für die Zufuhrfreier ω-3-Fettsäuren dar. Da bei vielen Patienten mit septischen

192. Materialien und Methoden2.1. Materialien2.1.1. Rezepturen der Puffer und NährmedienElastase-Messpuffer1,21 g Trispuffer (Trometamol)+5,62 g NaCl

Aus dem Medizinischen Zentrum für Innere Medizin, Medizinische Klinik und Poliklinik IIDirektor: Prof. Dr. SeegerKlinische Forschergruppe Respiratoris

20+1 n NaOH ad pH 7,4HBS (HEPES-Buffered Saline)-Puffer (0,5l):500 ml Aqua Dest.+2,383 g HEPES+4 g NaCl+1 n NaOH ad pH 7,6HEPES (N-2-Hydroxyethylpip

21RPMI 1640 Medium, Boehringer (Mannheim, Deutschland)Waymouth MB 752/1-Medium, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)2.1.2. Reagenzien und PharmakaA 231

22Eisessig, Merck (Darmstadt, Deutschland)Ficoll-Paque, Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)FMLP (N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin), Sigma (

232.1.3. Authentische StandardsLTB4, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)LTC4, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)LTD4, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)L

24Cedex, Frankreich)2.1.5. GeräteAbsorbance Detector Spectroflow 773, Kratos, über BAI (Weiterstadt, Deutschland)Beta-Szintillationscounter 1900 TR,

252.2. Methoden2.2.1. Isolation humaner GranulozytenDie Isolation humaner Polymorphkerniger Granulozyten (PMN) erfolgte unter sterilenArbeitsbedingung

26PMN erneut zentrifugiert und anschließend in 600 µl Hanks/HEPES- Puffer (mit Calcium undMagnesium) je 10 Mio. Zellen aufgenommen.Die Reinheit der i

27Anschließend wurde mit 1 µM A 23187 pro Well stimuliert und der Versuchsansatz nach 15'durch Kühlung der Platten auf Eis abgestoppt. Die Überst

28in der Küvette gut durchmischt. Nach 60 Sekunden Inkubationszeit im Photometer wurde anhandvon 20 Messungen der Extinktionszunahme über 3 Minuten di

29CHPLC-Qualität" zur Anwendung. Als feste Phase diente eine mit 3 µm ODS-Hypersil gepackteSäule (Länge 25 cm, Innendurchmesser 4,6 mm). Diese wu

3Inhaltsverzeichnis1. Einleitung...81.1. Vorwort...

30StandardRecovery (% +/- SEM)6t-LTB4 + 6t,12e-LTB492,0  3,1LTB490,8  1,45-HETE71,9  4,16t-LTB5 + 6t,12e-LTB586,4  1,9LTB587,8  2,85-HEPE76,1  3

31Wells verbliebenen Zellen mit 0,5%igem Triton-X lysiert und mit einem Cell-Scraper aus denWells entfernt. Die Aktivität sowohl im Probenüberstand, a

3270 Mio. der Granulozyten wurden nach der Isolation in 700 µl RPMI 1640-Mediumsuspendiert. Nach Zugabe von 50 µl [3H]-Inositol (entsprechend 50 µCi)

333. Ergebnisse3.1. Einfluß der Vorinkubation von Endothelzellen mit Eicosapenta-ensäure versus Arachidonsäure auf die Immunantwort koinku-bierter PMN

343.1.2. Produktion von LipoxygenasemetabolitenDie im Zellüberstand gemessene Freisetzung von LTB4 durch PMN ohne HUVECs lagbei 42,2  5 nmol/l. Nur u

353.1.3. Adhärenz von PMN an ECZum Vergleich der Adhärenz von PMN an HUVECs, die mit AA, EPA oder nicht mitfreier Fettsäure vorinkubiert worden waren,

363.2. Auswirkung der selektiven Inhibition zweier Enzyme auf Degra-nulationsreaktion und Produktion von Lipoxygenasemetabolitendurch PMN am Inkubatio

37freie Fettsäure waren nicht mehr auszumachen (Abb. 18).Die Menge an nichtenzymatischen Zerfallsprodukten und 5-HETE sank um vergleichbareWerte wie d

3812345678Elastase [U/l]PMN00,51510FFA [µmol/l]EPAAAohne FFAPMN ohne HUVECs**Abbildung 4: Änderung der Elastaseaktivität im Zellüberstand nach vorheri

393040506070LTB4 [nmol/l]PMN00,51510FFA [µmol/l]EPAAAPMNohne FFA***Abbildung 5: LTB4-Ausschüttung in den Zellüberstand nach vorheriger Inkubation derE

42.1.5. Geräte...242.2. Methoden...

4010203040506070805-HETE [nmol/l]PMN00,51510FFA [µmol/l]PMNohne FFAAAEPA*Abbildung 6: Ausschüttung von 5-HETE in den Zellüberstand. Stimulation mit 1

4110203040506-t-LTB4 + 6-t,12-e-LTB4 [nmol/l]PMN00,51510FFA [µmol/l]PMN ohne HUVECsohne FFAEPAAAAbbildung 7: Ausschüttung der LTA4-Zerfallsprodukte (6

42010203040[nmol/l]0,51510EPA [µmol/l]LTB56-t + 6-t,12-e5-HEPEAbbildung 8: Synthese von EPA-abgeleiteten Produkten der 5-Lipoxygenase durchPMN nach vo

43203040506070adhärente PMN [%]00,10,51510FFA [µmol/l]AAEPAohne FFA, ohne fmlpohne FFA***Abbildung 9: Adhärenz von PMN an EC nach vorheriger Inkubatio

448090100110120130140150IPx [% von Leerwert]012345678910t [min] (ohne FFA)012345678910t [min] (AA)ohne FFA1µM AAAbbildung 10: Zeitlicher Verlauf der I

458090100110120130140150160IPx [% von Leerwert]012345678910t [min]ohne FFA1µM EPAAbbildung 11: Zeitlicher Verlauf der Inositolphosphatbildung von PMN

46024681012Elastase [U/l]ohne ASA30 min. ASA150 min. ASAohne FFAPMN ohne HUVECs5 µM AA5 µM EPAAbbildung 12: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibition mi

47010203040506070 LTB4 [nmol/l]ohne ASA30 min. ASA150 min. ASAohne FFAPMN ohne HUVECs5µM EPA5µM AAAbbildung 13: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibitio

480204060801001205-HETE [nmol/l]ohne ASA30 min. ASA150 min. ASAohne FFAPMN ohne HUVECs5µM EPA5µM AAAbbildung 14: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibiti

490102030406-t + 6-t,12-e LTB4 [nmol/l]ohne ASA30 min. ASA150 min. ASAohne FFAPMN ohne HUVECs5µM EPA5µM AAAbbildung 15: Auswirkung der Cyclooxygenasei

53.2. Auswirkung der selektiven Inhibition zweier Enzyme aufDegranulationsreaktion und Produktion von Lipoxygenase-metaboliten durch PMN am Inkubation

50020406080[nmol/l]ohne ASA30 min. ASA150 min. ASALTB 56-t + 6-t,12-e5-HEPEAbbildung 16: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibition mit Acetylsalicylsäur

51012345678Elastase [U/l]keine InhibitionHUVECs inhibiertohne FFA5µM AA5µM EPAPMN ohne ECAbbildung 17: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der

5201020304050607080LTB4 [nmol/l]keine InhibitionHUVECs inhibiertohne FFA5µM AA5µM EPAPMN ohne ECAbbildung 18: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibiti

530102030405-HETE [nmol/l]keine InhibitionHUVECs inhibiertohne FFA5µM AA5µM EPAPMN ohne ECAbbildung 19: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der

540481216206-t + 6-t,12-e-LTB4 [nmol/l]keine InhibitionHUVECs inhibiertohne FFA5µM AA5µM EPAPMN ohne ECAbbildung 20: Auswirkung der Phospholipase A2-I

550102030[nmol/l]keine InhibitionHUVECs inhibiertLTB 56-t+6-t,12-e-LTB 55-HEPEAbbildung 21: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der EC auf die

564. Diskussion4.1. Modulation der Immunantwort von PMN durch Eicosapentaen-säure4.1.1. Verminderung der DegranulationsreaktionDie Freisetzung verschi

574.1.2. Verändertes Profil der LipoxygenasemetaboliteDie Bildung von LTB4 und 5-HETE durch PMN unter Koinkubation mit Endothelzellenwird durch die vo

58der Zellmembran gespeicherten AA die Menge der im Versuch zugeführten EPA bzw. AA ja weitübersteigt. Dies würde die Beobachtung unterstützen, daß EP

59nur mit PMN ohne EC durchgeführt, die erhöhte Adhärenz wurde an Kunststoffwells gemessenund auf eine erhöhte Expression von CD11b-Rezeptoren auf den

66. Literaturverzeichnis...667. Lebenslauf...

604.1.4. Veränderung der SignaltransduktionAuf eine Modulation der Signaltransduktion in PMN deuten die Ergebnisse bezüglich derBildung von Inositolph

61auch LTB4 können die Second-Messenger-Reaktion (und damit die Inositolphosphatbildung)auslösen bzw. verstärken, was wiederum zu vermehrter LTB4-Prod

62Lipoxygenaseprodukte beurteilen zu können. In früheren Untersuchungen am Tiermodell konntegezeigt werden, daß eine Inhibition der Cyclooxygenase die

63Dieser Effekt konnte in den durchgeführten Versuchen gezeigt werden: Unter Inhibitionder Phospholipase A2 der EC sank die Bildung von Leukotrienen s

645. ZusammenfassungDie Interaktion von Polymorphkernigen Neutrophilen Granulozyten und Endothelzellenspielt eine zentrale Rolle in der Enstehung infl

65blieb eine Inhibition der Cyclooxygenase weitgehend ohne Effekt.Des weiteren konnte die Herabsetzung der Adhärenz von PMN an EPA-gefüttertenEndothel

666. Literaturverzeichnis 1Brigham, K. L., Meyrick, B.: Interactions of granulocytes with the lungs. Ci

67

68

69

7AbkürzungenAA Arachidonsäure (arachidonic acid)EC Endothelzelle (endothelial cell)EPA Eicosapentaensäure (eicosapentaenoic acid)HEPE Hydroxyeicos

70

71

72

73

81. Einleitung1.1. VorwortDie vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Mai 1995 bis April 1996 in der Kli-nischen Forschergruppe "Respiratoris

9Diese gehören zu der Gruppe der Selectine (P-, E-, L-Selectin), durch die zunächst eine lockereBindung zustandekommt - die PMN "rollen" auf