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2.2. Methoden

2.2.1. Isolation humaner Granulozyten

Die Isolation humaner Polymorphkerniger Granulozyten (PMN) erfolgte unter sterilen

Arbeitsbedingungen mit Hilfe eines Ficoll-Paque Gradienten nach der Methode von Boyum (

Das Prinzip der Trennung einzelner Zelltypen durch einen Dichtegradienten beruht auf deren

unterschiedlichen Sedation durch den Gradienten bei der Zentrifugation: Während Monozyten

und Lymphozyten sich in der oberen Schicht des Gradienten sammeln, wandern Erythrozyten und

Granulozyten aufgrund ihrer höheren Dichte durch ihn hindurch.

Bei freiwilligen Spendern wurde aus der Cubitalvene Blut entnommen und im Verhältnis

1:2 mit PBS-Puffer (ohne Calcium und Magnesium) verdünnt. Das verdünnte Blut wurde auf

Ficoll-Paque-Gradienten aufgeschichtet und bei 350 x g 35 Minuten lang zentrifugiert. An-

schließend wurden die oberen Phasen (Serum, Mononukleäre Zellen, Ficoll-Gradient) abgenom-

men und verworfen. Die unterste Phase, bestehend aus Erythrozyten und Granulozyten wurde

im Verhältnis 1:3 verdünnt mit Polyvinylalkohol (PVA) und gut durchmischt. Nach 15 Minuten

Sedimentationszeit für die Erythrozyten wurde wiederum die obere Phase (PVA und PMN)

abgenommen und in ein neues Gefäß gegeben, die sedimentierten Erythrozyten wurden verwor-

fen. Nach anschließender Zentrifugation bei 250 x g für 10 Minuten und absaugen des

PVA-Überstandes verblieb ein granulozytenreiches Pellet. Es folgte die hypotone Lyse der

restlichen Erythrozyten mit eisgekühltem Aqua Dest. für 20 Sekunden. Der Ansatz wurde

wiederum bei 250 x g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, das Erythrozyten-freie PMN-Pellet

in PBS-Puffer (ohne Calcium und Magnesium) resuspendiert. Jetzt konnte die Zahl der PMN

lichtmikroskopisch in der Neubauer-Zählkammer bei 400facher Vergrößerung bestimmt werden.

Nach erneuter Zentrifugation (250 x g, 10 Minuten) wurden die PMN in RPMI 1640 Medium

gegeben und ca. 30 Minuten im CO

-Inkubator aufbewahrt. Zum Einsatz im Versuch wurden die

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